タンパク質ナノブロック等に利用可能な超安定化柱状二量体人工タンパク質

技術概要

　一般にタンパク質は熱等に弱く変性しやすいという問題があり、ナノ材料としての応用を考える場合には、ナノブロックを構成する柱状タンパク質の安定性向上が不可欠である。本発明は従来のドメインスワップ二量体人工タンパク質の構造安定性を大幅に向上させ、ナノ構造を構築するタンパク質ナノブロックとして好適に利用することが可能となる。

用途・応用

人工タンパク、ナノ材料

背景

　人 工 タ ン パ ク 質 （ デ ノ ボ タ ン パ ク 質 ： de novo protein） と は 、 天 然 タ ン パ ク 質 の ア ミノ酸配列をもとにせず、新規にアミノ酸配列を設計したタンパク質のことである。タンパク質を自在にデザインし、望みの機能を実現することができるようになれば、医薬品開発や環境負荷の少ない酵素反応、さらにはナノバイオテクノロジーの発展に大きく貢献することができると考えられ、タンパク質工学研究の究極的目標である。
し か し な が ら 、 一 般 に 20種 類 の ア ミ ノ 酸 を ラ ン ダ ム に 100残 基 つ な げ る と す る と 20（1 0 0乗）＝約 1.3× 10（1 3 0乗）通りもの莫大な組み合わせがあり、その中から安定な構造や優れた機能を持つタンパク質の配列を探索することは極めて困難である。

　人工タンパク質（デノボタンパク質）の設計は、主に三種類の方法で行われている。すなわち、立体化学的及び物理化学的なアプローチにより合理的に設計する方法（非特許文献１、非特許文献２）と、ランダムなアミノ酸配列の組合せを持つタンパク質ライブラリー に よ り 設 計 す る 方 法 （ 非 特 許 文 献 ３ ） と 、 プ リ ン ス ト ン 大 学 の M ichael Hecht教 授 に よるバイナリーパターン法を利用して半合理的に人工タンパク質を創製する方法（非特許文献４、５）である。

　バイナリーパターン法とは、水溶性球状タンパク質の表面には親水性アミノ酸が多く、内部には疎水性アミノ酸が多く存在する性質に着目して、目的タンパク質の二次構造・三次 構 造 に 応 じ て 、 親 水 性 ア ミ ノ 酸 (Asn、 Asp、 Gln、 Glu、 His、 Lys)と 疎 水 性 ア ミ ノ 酸 (Ile、 Leu、 M et、 Phe、 Val)の 繰 り 返 し 配 列 パ タ ー ン を デ ザ イ ン す る 方 法 で あ る 。
　これまでに、バイナリーパターン法を用いてαヘリックスやβシート構造を含むいくつかのデノボタンパク質ライブラリーの作製例が報告されている（非特許文献５）。

図 １ (a)（各図はダウンロード資料に記載）は 、 バ イ ナ リ ー パ タ ー ン 法 に よ り 作 製 す る 4本 ヘ リ ッ ク ス デ ノ ボ タ ン パ ク 質 の 設計例である。数珠状の球の一つ一つがアミノ酸残基を示す。やや濃い色の球が親水性残基、 薄 い 色 の 球 が 疎 水 性 残 基 、 濃 い 色 の 球 が ル ー プ 領 域 に 対 応 す る 残 基 を 表 す 。 図 １ (b)は、 ４ 本 へ リ ッ ク ス デ ノ ボ タ ン パ ク 質 の バ ン ド ル 構 造 を 断 面 方 向 か ら 見 た 模 式 図 で あ る 。 3～ 4残 基 ご と に 疎 水 性 ア ミ ノ 酸 残 基 を 配 置 す る こ と に よ り 、 4本 の へ リ ッ ク ス か ら な る バ ンドル（束）の中心側に疎水性アミノ酸残基が位置し、バンドルの外側に親水性アミノ酸残基 が 位 置 す る よ う に 設 計 さ れ て い る 。 親 水 性 残 基 に は Asn， Asp， Gln， Glu， His， Lys、 疎水 性 残 基 に は Ile， Leu， M et， Phe， Val、 ル ー プ 領 域 に は Arg， Asn， Asp， Gln， Glu， Gly， His， Lys， Serの い ず れ か の 残 基 が 配 置 さ れ る 。

図 ２ (a)は 、 バ イ ナ リ ー パ タ ー ン 法 を 用 い て 作 製 し た 人 工 設 計 タ ン パ ク 質 W A20の 立 体 構造 を 示 す （ 非 特 許 文 献 ６ ） 。 人 工 タ ン パ ク 質 W A20の 単 量 体 は 、 図 ２ (b)に 示 す よ う に 、 2本の 長 い α ヘ リ ッ ク ス が ル ー プ に よ っ て 連 結 し た ＂ ヌ ン チ ャ ク ＂ の よ う な 構 造 を と る 。 W A20は溶液中においては、二分子間で双方のヘリックス部分が互いに挟み込むようにして組み合 わ さ っ た 、 4本 ヘ リ ッ ク ス バ ン ド ル 二 量 体 構 造 を と り 安 定 に 存 在 す る 。 図 ２ (a)は 、 各 々の ヘ リ ッ ク ス が 組 み 合 わ さ っ た W A20の 立 体 構 造 を 示 す 。 4本 の ヘ リ ッ ク ス が 二 分 子 間 で 相互に挟み込まれるようにしてバンドルを形成することから、この分子間フォールディングによる４本ヘリックスバンドル二量体構造を有する人工タンパク質をドメインスワップ二量体人工タンパク質と称している。
W A20の 単 量 体 の ア ミ ノ 酸 配 列 を 配 列 表 の 配 列 番 号 １ に 示 す 。 W A20単 量 体 は 102個 の ア ミノ酸残基からなる。

【先行技術文献】
【特許文献】
【 非 特 許 文 献 １ 】 Dahiyat, B. I. & M ayo, S. L. De Novo Protein Design: Fully Automated Sequence Selection. Science 278, 82－ 87 (1997).
【 非 特 許 文 献 ２ 】 Kuhlman, B., Dantas, G., Ireton, G. C., Varani, G., Stoddard, B.L. & Baker, D. Design of a novel globular protein fold with atomic‑level accuracy. Science 302, 1364－ 1368 (2003).
【 非 特 許 文 献 ３ 】 Keefe、 A. D. & Szostak、 J. W . Functional proteins from a random‑sequence library. Nature 410, 715－ 718 (2001).
【 非 特 許 文 献 ４ 】 Kamtekar, S., Schiffer, J. M ., Xiong, H., Babik, J. M . & Hecht,M . H. Protein design by binary patterning of polar and nonpolar amino acids. Science 262, 1680－ 1685 (1993).
【 非 特 許 文 献 ５ 】 Hecht, M . H., Das, A.、 Go, A., Bradley, L. H. & W ei, Y. De novoproteins from designed combinatorial libraries. Protein Science 13, 1711‑1723 (2004).
【 非 特 許 文 献 ６ 】 Arai, R., Kobayashi, N., Kimura, A., Sato, T, M atsuo., K, W ang,A., F., Platt, J.M ., Bradley, L. H. & Hecht, M .H. Domain‑Swapped Dimeric Structure of a Stable and Functional De Novo 4‑Helix Bundle Protein, W A20. Journal of Physical Chemistry B., 12, 6789－ 6797 (2012).
【 非 特 許 文 献 ７ 】 Erijman, A., Dantes, A., Bernheim, R., Shifman, J.M .&Peleg, Y. Transfer‑PCR (TPCR): A highway for DNA cloning and protein engineering .Journal of Structural Biology, 175 171‑177 (2011).
【 非 特 許 文 献 ８ 】 Inoue, H., Nojima, H. & Okayama, H. High efficiency transformation of Escherichia coli with plasmids. Gene 96, 23－ 28 (1990).
【 非 特 許 文 献 ９ 】 Kobayashi, N., Yanase, K., Sato, T., Unzai, S., Hecht, M .H., & Arai, R. Self‑assembling nano‑architectures created from a protein nano‑buildingblock using an intermolecularly folded dimeric de novo protein. Journal of the American Chemical Society, 137, 11285‑11293 (2015).
【非特許文献１０】山下一郎、芝清隆　バイオナノプロセス　溶液中でナノ構造を作るウェ ッ ト ・ ナ ノ テ ク ノ ロ ジ ー の 薦 め . シ ー エ ム シ ー 出 版 （ 2008） .

課題

　上 述 し た 人 工 設 計 タ ン パ ク 質 W A20（ ド メ イ ン ス ワ ッ プ 二 量 体 タ ン パ ク 質 ） は 、 図 ２ (a)に示す特徴的な二分子間でフォールディングされた細長い円柱状の立体構造を備えていることから、その構造的特徴を活かすことにより、種々のナノ構造複合体を構成するパーツとなるタンパク質ナノブロックとして好適に応用利用することが可能である。人工設計タンパク質をタンパク質ナノブロックとして利用する利点としては、自発的に集合して規則正しい構造をデザイン形成できること、タンパク質は酵素を代表とする生体機能高分子としての機能を有するから所望の生体機能を付与できること等が挙げられる。
　しかしながら、タンパク質は熱や酸・塩基等に弱く、変性しやすいという問題があり、ナノ構造複合体を構成する材料としての応用利用を考える場合には、ナノブロックを構成するタンパク質の安定性向上が不可欠である。
　本 発 明 は 、 従 来 の ド メ イ ン ス ワ ッ プ 二 量 体 タ ン パ ク 質 W A20の 構 造 安 定 性 を 向 上 さ せ 、 ナノ構造複合体を構築するタンパク質ナノブロックとして好適に利用することを可能にするドメインスワップ二量体人工タンパク質を提供することを目的とする。

手段

　本発明に係るドメインスワップ二量体人工タンパク質は、 二 本 の ヘ リ ッ ク ス が ル ー プ によ り 連 結 さ れ た ヌ ン チ ャ ク 型 構 造 を 備 え る タ ン パ ク 質 の 単 量 体 が 、 二 分 子 間 で 双 方 の ヘ リッ ク ス が 互 い に 挟 み 込 ま れ た ４ 本 ヘ リ ッ ク ス バ ン ド ル が 形 成 さ れ た ド メ イ ン ス ワ ッ プ 二 量体 人 工 タ ン パ ク 質 で あ っ て 、 前 記 ヌ ン チ ャ ク 型 構 造 を 備 え る そ れ ぞ れ の 単 量 体 が 、 配 列 番号 １ に 示 さ れ た 人 工 タ ン パ ク 質 W A 2 0の ア ミ ノ 酸 配 列 に お い て 、 下 記 （ １ ） の 置 換 が 施 さ れた も の で あ る 。
（ １ ） ２ ６ 番 目 の ヒ ス チ ジ ン が ロ イ シ ン で 置 換 さ れ 、 か つ ７ ８ 番 目 の グ ル タ ミ ン 酸 が ロイ シ ン で 置 換 さ れ て い る 。

効果

　本発明に係るドメインスワップ二量体人工タンパク質は、従来のドメインスワップ二量体人工タンパク質と比較してはるかに構造が安定であり、ナノ構造複合体を構成するタンパク質ナノブロック等として有効に利用することができる。

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