哺乳類個体におけるin vivoイメージングが可能な近赤外蛍光プローブの開発

2022.08.17 By 静岡大学

バイオ

技術概要

哺乳類内在色素・ビリベルジンを結合する分子の配列を基に、ビリベルジン結合に重要な4つのアミノ酸残基を導入することで、ビリベルジン結合型分子の合理的設計に成功した。

用途・応用

哺乳類個体におけるin vivo蛍光イメージング、オプトジェネティクス

背景

 光は時間・空間分解能が高く、また、波長及び強度という二つのパラメーターによって細かく制御することができる。そのため、細胞内におけるタンパク質の局在などの測定に、緑色蛍光タンパク質(GFP)などの蛍光分子による、光を利用する分子イメージング手法が近年利用されている。しかしながら、細胞に存在する様々な要因(ヘモグロビン、メラニン、水など)により、低波長領域の光の多くは吸収されてしまうことから、低波長領域の光を吸収して蛍光を発するGFPなどの蛍光分子を生体内で利用しようとすると、励起光が蛍光分子まで届きにくく、また蛍光の検出も困難であった。そのため、生体内での分子イメージングには、吸収され難い長波長光吸収型の蛍光分子が望まれている。

 近年、長波長領域の光を吸収するビリベルジン(BV)と結合するバクテリオフィトクロムという光受容体が注目されている。バクテリオフィトクロムは、ビリベルジンと共有結合することで、700nm及び750nmの波長により、可逆的に光変換する光受容体である。バクテリオフィトクロムを用いた蛍光プローブは、色素を結合するタンパク質領域の分子量が比較的大きく、また、タンパク質が二量体以上の多量体を形成するという問題がある。

 この問題を解決するために、シアノバクテリオクロムを利用した蛍光プローブが提案されている。シアノバクテリオクロムは、フィコシアノビリン(PCB)及びフィコビオロビリンなどの開環テトラピロールと結合し、紫-青/緑色光、紫/黄色光及び緑/赤色光の間で可逆的に光変換を示す。シアノバクテリオクロムは、25kDa程度の発色団結合ドメイン(GAFドメイン)単量体で色素と結合することができるため、バクテリオフィトクロムを用いた蛍光プローブよりも低分子で利用できる。シアノバクテリオクロムの2番目のGAFドメインであるAM1_1557g2にBVが結合した蛍光プローブが提案されている(特許文献1)。

【先行技術文献】
【特許文献】
【特許文献1】特許第6404665号公報

課題

 本願発明は、哺乳動物個体のインビボイメージングに利用可能なタンパク質を提供することを目的とする。

手段

 本発明者らは、シアノバクテリオクロムNpF2164の5番目のGAFドメインであるNpF2164g5に、4つのアミノ酸残基に変異を導入することで、BV非結合性のNpF2164g5がBV結合性に変化することを見出し、この変異体タンパク質をNpF2164g5_BV4と名付けた。また、BVが結合したNpF2164g5_BV4をマウス個体に導入することで、非侵襲的に肝臓をイメージングできることを見出した。本発明者らは、これらの知見に基づいて、本発明を完成するに至った。

 すなわち、本発明は、以下の[1]~[6]に関する。
[1] 配列番号1に記載のアミノ酸配列と90%以上の同一性を有し、ビリベルジン結合性であるタンパク質。
[2] 上記[1]に記載のタンパク質に、配列番号1に記載のアミノ酸配列の95番目又はそれに相当するシステイン残基を介してビリベルジンが結合した、複合体。
[3] 上記[1]に記載のタンパク質をコードする核酸。
[4] 上記[3]に記載の核酸を含むベクター。
[5] 上記[4]に記載のベクターを含む形質転換体。
[6] 上記[5]に記載の形質転換体を培養することを含む、上記[1]に記載のタンパク質の製造方法。

効果

 本発明のタンパク質は、哺乳動物個体のインビボイメージングへの利用可能性がある。

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特許情報

特願2019-035694

JPA 2020138930-000000